造血干細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)步驟

1、胚胎成纖維細胞的復蘇：胚胎干細胞一般是在37℃、5%CO2和95%濕度的培養(yǎng)條件下，生長在鋪有一層滋養(yǎng)細胞層的細胞培養(yǎng)皿或者是細胞培養(yǎng)瓶中（此處以細胞培養(yǎng)皿為例）。因此要先鋪滋養(yǎng)層細胞。在37℃水浴鍋里快速融化一管液氮凍存的小鼠胚胎成纖維細胞。把融化的細胞懸浮液加到裝有幾毫升預熱好的MEF培養(yǎng)基的無菌離心管中，輕輕混勻后，1000×g ，5min離心收集細胞。吸掉上清（除去凍存液中的DMSO），用10ml預熱的MEF培養(yǎng)基重懸細胞后，加到一個10cm的細胞培養(yǎng)皿中，放入37℃，含有5%CO2的加濕培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據情況對細胞進行換液，大約4天左右，細胞就可以基本長滿整個培養(yǎng)皿，這時可以進行傳代、凍存或用于制備滋養(yǎng)細胞層。

2、滋養(yǎng)細胞層的制備：把長好的小鼠胚胎成纖維細胞的培養(yǎng)基吸掉，加入10ml新鮮的MEF培養(yǎng)基，并在避光的條件下加入110μl配好的絲裂霉素C，混勻后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h。把含有絲裂霉素C的培養(yǎng)基用無菌的15ml離心管收集起來避光保存，在一周之內可再次使用（直接使用該培養(yǎng)基處理細胞5h）。用PBS(不含二價離子)洗滌細胞2到3次后，用1ml含有EDTA的胰酶消化細胞，37℃培養(yǎng)箱放置約3min，直到細胞懸浮起來。用1ml MEF培養(yǎng)基中和胰酶的作用，之后把細胞收集到離心管里，1000×g離心5min。去掉上清，用1ml MEF培養(yǎng)基重懸細胞，之后把細胞平均分到兩個經過0.1%明膠處理過的細胞培養(yǎng)皿

中，用MEF培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。（明膠處理：加5ml 0.1%的明膠到細胞培養(yǎng)皿中，在37℃培養(yǎng)箱中至少放置10min，之后把明膠吸掉即可）。一般處理好的小鼠胚胎成纖維細胞在1~2h之后即可以貼壁，形成滋養(yǎng)細胞層，這時的滋養(yǎng)細胞層即可

用來培養(yǎng)小鼠胚胎干細胞。制備好的滋養(yǎng)細胞層可以在MEF培養(yǎng)基中保持1周左右的時間，或者是把細胞凍存。

3、小鼠胚胎干細胞（mouse embryonic stem cells，ES cells）的復蘇

4、小鼠胚胎干細胞的傳代

5、小鼠胚胎干細胞的凍存

造血干細胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)注意事項：

1、絲裂霉素C在操作時要避光，避免其分解。

2、ES細胞傾向于聚集生長，因此在復蘇時，要選擇好培養(yǎng)皿的規(guī)格

3、ES細胞不能長的太滿，應避免使各個克隆之間接觸，以免發(fā)上分化。

4、為避免水或血清帶來的污染，對血清應進行支原體檢測，配好的培養(yǎng)基要進行污染測試。