目前，神經(jīng)干細(xì)胞的分離方法主要有三種：無血清培養(yǎng)基自然篩選法、流失細(xì)胞術(shù)分選法、免疫磁珠分選法。我司采用的是神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基的自然篩選法。
神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基自然篩選法是迄今應(yīng)用，也是zui簡單和容易操作且行之有效的方法。其原理是利用特殊的培養(yǎng)基使成熟的神經(jīng)細(xì)胞無法較長時間地成活，而分離篩選出能夠在該培養(yǎng)條件下存活并增殖的神經(jīng)干細(xì)胞群體。首先將含神經(jīng)干細(xì)胞的神經(jīng)組織通過機(jī)械或酶解分散等方法制備成單細(xì)胞，然后培養(yǎng)于含有特殊營養(yǎng)添加劑和促增殖因子的不含血清的培養(yǎng)液中。非神經(jīng)干細(xì)胞在這種培養(yǎng)系統(tǒng)中由于營養(yǎng)缺陷無法較長時間地存活，而神經(jīng)干細(xì)胞則適應(yīng)該培養(yǎng)體系并在促增殖因子作用下生長增殖。因此，經(jīng)過培養(yǎng)一段時間之后，就可獲得通過這種自然篩選而增殖形成的呈神經(jīng)球狀生長的神經(jīng)干細(xì)胞群體。這種利用特殊培養(yǎng)基自然篩選神經(jīng)干細(xì)胞方法的優(yōu)點是：簡便易行，不需要特殊的儀器設(shè)備等條件，分離效率高，神經(jīng)干細(xì)胞損傷小易于成活。
我公司分離培養(yǎng)神經(jīng)干細(xì)胞的步驟大致如下：
?。?） 取胎腦。
?。?） 加Trypsin/EDTA消化，用吸管吹吸使細(xì)胞均勻分散均勻。
?。?） 離心除去Trypsin/EDTA。
?。?） 加神經(jīng)干細(xì)胞*培養(yǎng)基培養(yǎng)。
當(dāng)神經(jīng)球較大或出現(xiàn)細(xì)胞貼壁分化時應(yīng)及時傳代。傳代經(jīng)過大致為：去除培養(yǎng)液；PBS洗滌；Trypsin/EDTA消化；離心，去上清；神經(jīng)干細(xì)胞*培養(yǎng)基重懸；按比例接種。神經(jīng)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)，選用合適的體外培養(yǎng)條件至關(guān)重要。目前，神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)常規(guī)使用的培養(yǎng)基為DEME/F12（1:1）加上無血清營養(yǎng)添加劑B27和堿性成纖維細(xì)胞生長因子,也有應(yīng)用添加劑N2或表皮生長因子等。在此培養(yǎng)體系中神經(jīng)干細(xì)胞呈神經(jīng)球狀生長，即增殖的細(xì)胞不貼附于培養(yǎng)器皿上，而是圓形的細(xì)胞彼此黏附在一起形成小球狀懸浮于培養(yǎng)液中生長。當(dāng)采用一些方法將其分散成單細(xì)胞后，既可由單個細(xì)胞增殖成神經(jīng)球，也可由數(shù)個細(xì)胞重聚集后形成小神經(jīng)球結(jié)構(gòu)，然后小神經(jīng)球再增殖成較大的神經(jīng)球。這些神經(jīng)球中，外周的細(xì)胞為新增殖的細(xì)胞，生長較為旺盛，而在神經(jīng)球中央，特別是直徑較大的神經(jīng)球可見到有一些細(xì)胞出現(xiàn)凋亡或壞死，有部分可發(fā)生自主分化，表現(xiàn)為帶短突起的細(xì)胞。所以，當(dāng)神經(jīng)球長到一定大小要及時傳代。要維持神經(jīng)干細(xì)胞在體外生長，在培養(yǎng)體系中需要加入絲裂原來促進(jìn)其增殖，大多數(shù)采用bFGF。適當(dāng)濃度的bFGF可使神經(jīng)干細(xì)胞的增殖能力達(dá)到zui大，但高濃度卻會促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化。
神經(jīng)干細(xì)胞在體外培養(yǎng)另外很重要的一點就是如何盡量讓其少分化或不分化，除了神經(jīng)干細(xì)胞本身的特性決定了一部分不對稱分裂的細(xì)胞必將發(fā)生自主分化外，培養(yǎng)條件對神經(jīng)干細(xì)胞的分化與否影響很大，比如在培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)，將神經(jīng)干細(xì)胞球培養(yǎng)于塑料器皿，其黏附于器皿表面并發(fā)生分化的可能要比培養(yǎng)于玻璃器皿的高很多。另外，某些底物如多聚賴氨酸或多聚尿氨酸、作為細(xì)胞外基質(zhì)的的層黏臉蛋白、膠原等都能在無特殊誘導(dǎo)劑存在的情況下，促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的貼壁而分化。神經(jīng)干細(xì)胞在體外分化的形態(tài)表現(xiàn)為由圓形變成帶有明顯突起、形態(tài)各異的神經(jīng)細(xì)胞，懸浮的神經(jīng)球出現(xiàn)貼壁呈圓盤狀，形態(tài)各異的細(xì)胞向周圍呈放射狀長出并遷移，甚至全部細(xì)胞均分化平鋪于器皿上生長。培養(yǎng)液中bFGF除了對神經(jīng)干細(xì)胞的分裂增殖起著關(guān)鍵的作用外，對神經(jīng)干細(xì)胞分化的作用也很重要。當(dāng)培養(yǎng)液中撤除bFGF時能夠?qū)е律窠?jīng)干細(xì)胞的分化，但較高濃度的bFGF卻也能促進(jìn)神經(jīng)干細(xì)胞的分化。
